تبلیغات
زیست شناسی - اکسین

اکسین

سه شنبه 4 خرداد 1389 02:43 ب.ظنویسنده : سید حسین نقیبی

 

ترارسانی علامت هورمون اكسین
(Auxin Signaling)


فرآیندهای بسیاری در عرض چند دقیقه پس از به كار بردن هورمون گیاهی اكسین بر روی بافت گیاهی رخ می دهد. این اثرات باعث تغییرات سریع در فعالیت های انزیمی و بیان ژن و تغییر در فعالیت ناقلین می شود كه نهایتا منجر به اسیدی شدن دیواره سلولی، افزایش سریع در پتانسیل غشایی یا میزان كلسیم سیتوسولی می شود. سوال اساسی در زیست شناسی اكسین این بوده است كه چطور چنین مولكول ساده ای این صف مختلف و متناوب پاسخ ها را كنترل می كند. بیشتر این پاسخ های اولیه مسیر ترارسانی علامت هنوز ناشناخته است.



ژن های پاسخ دهنده به اكسین




رویدادهای مولكولی اولیه برای روشن كردن عمل اكسین مشخص کرده است كه هورمون تغییرات خاص و سریعی را در ارتباط با بیان ژن القا می كند و در این راستا چندین ژن پاسخ دهنده به اكسین شناسایی شد. از جمله بیشترین موارد مشخص شده 3 خانواده ژنی SAURs و GH3s و AUX/IAA هستند كه به سرعت در پاسخ به اكسین تحریك شدند.
(SAURs) SMALL AUXIN-UP RNAs ، در ابتدا در soy bean شناسایی شد به طوریكه پس از تیمار كمی از اكسین تجمع سریع رونوشت ها را در پی داشت. ژنهای SAUR در بسیاری دیگر از گیاهان شناسایی شده است، مانند آرابیدوبسیس چند تا از رونوشت های SAUR به علت عناصر پایین حفظ شده در نواحی ترجمه نشونده 3 یافت شده conserved downstream element (DST) بسیار ناپایدار هستند. این رونوشت ها پروتئین های كوچك 9-15 KD را كد می كنند، آنالیز توالی آن، سرنخ های كمی از عمل آنها را حاصل كرد. در ذرت zmSAUR2 یكسری پروتئین هایی هسته ای با عمر كوتاه را نشان داده اند و هم zmSAUR2 و zmSAUR1 در شرایط آزمایشگاهی به صورت متصل به كالمودولین یافت شده اند. اینكه SAUR ها چه نقشی در ترارسانی علامت اكسین داشته باشد نامعلوم باقی مانده است.
آرابیدوبسیس حاوی 19 ژن GH3 می باشد، چند تا از انها توسط اكسین تحریك می شوند. یافته های اخیر نشان می دهد كه برخی از اعضا خانواده GH3 یك كلاس از آنزیم های acyl-adenylate-forming را كه می توانند به عنوان IAA- آمینوسنتاز در مورد IAA های متصل به آمینو اسید عمل كند را پیشنهاد می كند كه تحریك ژنهای GH3 توسط اكسین به عنوان مكانیزم پس خوردی می باشد كه سیگنال اكسین را توسط غیر فعال كردن IAA از طریق اتصال ، كاهش می دهد. در جوانه های آرابیدوبسیس بیان زیادی GH3.6 برای مقاومت به IAA نشان داده شده، جوانه های حاوی جهش های حاوی GH3.5 یا GH3.17 افزایش حساسیت را نشان دادند. باید توجه شود كه همه ژنهای GH3 تحریك شونده با اكسین نیستند، یا اینكه همه پروتئین های GH3 فعالیت IAA- آمینو سنتازی ندارند.
برای مثال GH3.11/JAR1 از طریق رونویسی توسط اكسین تنظیم نشد و در عوض عمل آن به عنوان یك جاسمونیك اسید-آمینوسنتاز نشان داده شده است.
ژنهای AUXIN/INDOLE-3-AGETIC ACID.سومین كلاس بزرگ رونوشت های تحریك شونده با اكسین را در بر می گیرد. در ابتدا ژن های AUX/IAA در سویا و نخود شناسایی شد و بعدا در بسیار دیگری از گیاهان شناسایی شد، مثلا آرابیدوبسیس حاوی یك خانواده ژنی 29 عضوی است. همانطور كه در مورد ژنهای SAUR تحریك شونده با اكسین گفته شد، تحریك AUX/IAA پی از چند دقیقه تیمار با اكسین بدون نیاز به سنتز پروتئین جدیدی اتفاق می افتد. میزان توسعه تحریك به اندازه بیان سینتیكی به طور قابل ملاحظه ای بین اعضای خانواده AUX/IAA متغییر است. ژنهای AUX/IAA پروتئین های 20-35 كیلودالتونی راكد می كنند كه در تمام موارد مورد ازمایش تا به اكنون نشان داده شده است كه در هسته قرار می گیرند.
چندین خط ژنتیكی و شواهد مولكولی بیان می كند كه عمل این پروتئین ها در پاسخ به اكسین عمل فاكتورهای رونویسی را مهار می كند. به استثنا كمی ، پروتئین های AUX/IAA چهار موتیف بسیار حفظ شده به نام دومین Iν,III,II,I دارد.
دومین III پایانه C و دومین IV با دیگر پروتئین های AUX/IAA و فاكتورهای پاسخ دهنده به اكسین(ARFs) دیمر می شوند كه آنها نیز این دوموتیف را دارند. دومین I به عنوان موتیف مهار كننده رونویسی عمل می كند ، دومین II در پایداری پروتئین AUX/IAA نقش داشته كه یك degron را تشكیل می دهد كه پروتئین AUX/IAA قابل تجزیه توسط مسیر پروتئولیتیك پرتئازوم یوبی كوئیتین s26 واین توالی توسط این مسیر تجزیه ای هدف گیری می شود. عمل این موتیف بسیار حفظ شده است و نقش پروتئین های AUX/IAA در پاسخ به اكسین با جزئیات بیشتر مورد بررسی قرار می گیرد.




فاكتورهای پاسخ دهنده به اكسین



نواحی تنظیمی بالا دست چندین ژن پاسخ دهنده به اكسین حاوی چندین كپی از توالی های حفظ شده TGTCTC می باشد. این توالی به عنوان عناصر پاسخ دهنده به اكسین AUXRE شناخته شده است. شناسایی توالی AUXRE باعث جداسازی ژن ARF1 در آرابیدوبسیس شد. و نهایتا، مطالعات مولكولی، ژنتیكی منجر به شناسایی 23 ژن ARF در آرابیدوبسیس شد. پروتئین های ARF در پایانه N خود دومین حفظ شده ای دارند كه متصل شوند به DNA است و اتصال به توالی AUXRE را تنظیم می كند. اكسین روی اتصال ARF به DNA تاثیری نداشت.
ARF ها در حالت عمومی حاوی 3 دومین شناخته شده اند: دومین متصل شونده به DNA (DBD) كه به AUXRE متصل می شود، یك دومین میان و دومین سومی كه برای تنظیم همو یا مترو دایمر شدن یافت شده است. اینكه ARF ها مهار كننده یا فعال كننده باشند بسته به ساختار دومین میانی آن است. برای مثال ARFs ها با ناحیه میانی Q-Rich رونویسی را فعال می كند، در حالیكه ARFs ها با ناحیه میانیS-Rich رونویسی را مهار می كند.
برهمكنش بین AUX/IAA و ARF ها باعث مهار بیان ژنهای تحریك شونده با ARF می شود و این مهار روی ARF زمانیكه پروتئین AUX/IAA تجزیه شود برداشته خواهد شد. در این مورد از جهش های با تقویت عملكرد پروتئین های AUX/IAA استفاده كردند، كه باعث غیر حساس شدن به اكسین شد. بسیاری از پروتئین های AUX/IAA عمر كوتاهی دارند و جهش های با تقویت عملكرد در ژن های AUX/IAA با تغییر امینو اسید خاصی در دومین II كه پایدار كننده است را به وجود می اورد و بنابراین پاسخ به اكسین مهار شده باعث ایجاد فتوتیپ غیر حساس به اكسین می شود. اكثر پروتئین های ARF همچنین حاوی ناحیه دیمر شونده پایانه C است كه بسیار وابسته به موتیف II و IV پروتئین های AUX/IAA می باشد.(میل تركیبی بالا). این دومین پایانه C ، تشكیل همودیمر بین پروتئین های ARF را به خوبی تشكیل هترودیمر شدن با پروتئین های AUX/IAA را تنظیم می كند.
در آزمایش بررسی اتصال DNA با تكرارهای AUXRE پالیندرومی پیشنهاد كرد كه دیمر شدن ARF-ARF ممكن است اتصال این فاكتورهای نسخه برداری را به محل هدفشان آسانتر كند، اما اخیرا با سنجش های بیشتر با به كار بردن ARF های بدون عناصر دیمر شونده C ترمینال نشان داد كه، دیمر شدن ARF برای اتصال به AUXRE ضروری نیست.
در این مورد فعالسازی ARF ها با دیمر شدن با پروتئین های AUX/IAA ، كنترل هورمونی فعالیت رونویسی ARF را بوجود می اورد. چندین عضو از خانواده AUX/IAA می تواند با ARFهای Q-Rich برهمكنش داشته باشد و فعالیت رونویسی را مهار كند.
اخیرا نشان داده شده كه دومینI در AUX/IAA می تواند به عنوان مهار كننده رونویسی عمل كند كه ممكن است مسئول تنظیم منفی باشد، در پاسخ به تحریك اكسین ، پروتئین های AUX/IAA توسط پروتئوزوم s26 مهار می شود. كاهش در مقدار پروتئین AUX/IAA مهار روی ARF Q-Rich را فرو می نشاند، در نتیجه افزایش رونویسی از ژنهای پاسخ دهنده به اكسین را داریم.(مكانیزم بیشتر توضیح داده خواهد شد.)
سازگار با این مدل، جهش هایی با عمل اكتسابی غالب در چندین ژن AUX/IAA جدا شده اند. كه به آنها فتوتیپ های وابسته به اكسین افزایش می دهد و پاسخ به اكسین را كاهش می دهد.
مطالعات مولكولی نشان داده شده است كه همه این جهش ها توالی دومینII را هدف می گیرند و باعث افزایش چشمگیری در پایداری مهار كننده جهش یافته AUX/IAA می شوند. بررسی چندین جهش یافته ARF از آرابیدوبسیس دیدگاهی در مراحل مختلف مربوط به اكسین در مورد تنظیم این فاكتورهای رونویسی را به وجود اورد.
جهش درETTIN/ARF3 S-Rich ARF غیر معمول را باعث می شود كه موتیف های دیمر شونده پایانه C را ندارد، نقص مشابهی در الگو gynocium با گل هایی كه انتقال اكسین در آنها توسط تیمار با بازدارنده NPA مشاهده شد. اتیلن و نور به عنوان HLS1 برای تنظیم مقدار پروتئین S-Rich ARF برای كنترل طویل شدن تمایزی سلول در هیپوكوتیل عمل می كند. جهش یافته های arf2 چندین فتوتیپ مثل افزایش اندازه در چندین ارگان، ساقه های بدون گراویت تروپیسم agravitropic و پیری و ریزش تاخیر یافته را نشان دادند، بررسی های microarray با استفاده از RNA از جوانه های هفت روزه arf2 تهیه شد كه هیچ نوع تغییر در بیان ژنهای تنظیم شونده با اكسین را نشان نداد. شواهد اخیر در حمایت این ، در مورد جهش یافته های دوتایی arf1 arf10 ، به علت تمایز سلولی راس ریشه نا به جا را به صورت رشد ریشه ای agravitropic نشان داد. در مورد ض Q-Rich ARFs ، جهش در monoPTEROUS (MPIARF5) نقایصی در الگو جنینی با چندین آلل بدون ساختارهای پایه ای را به وجود آورد. در مقابل، جهش در (NPH4/ARF5)NON-PHOTOTROPIC HYPOCTYL4 بعلت كاهش توسعه سلولی در پاسخ به اكسین باعث كاهش پاسخ تروپیك در بخش رویشی شد. فتوتیپ های جهش یافته های nph4 و mp نشان می دهد كه این 2 ARF پاسخ شاخص به اكسین را تنظیم می كنند. نتایج اخیر جهش های nph4 فتوتیپ افزایش بی ریشه بودن آلل های ضعیف mp را به وجود آورد پیشنهاد می دهد كه برخی عملكردها بین این دو فاكتور فعال كننده رونویسی با هم همپوشانی دارد. ARF19 نیز به طور زیادی همراه با ARF7 برای عمل خود ظاهر می شود جهش یافته های arf19 هیچ فتوتیپ ظاهری را نشان نمی دهد، arf19 نقایص تروپیك حاصل از nph4 را افزایش می دهد و جهش یافته های دوتایی فتوتیپ های وابسته به اكسین شدیدتری را مثل مقاومت طویل شدن ریشه وابسته به اكسین و كاهش در توسعه برگی و نمو ریشه های جانبی را نشان می دهد.
جهش یافته های arf8 ، افزایش غالبیت راسی ، ازدیاد ریشه های جانبی و افزایش هیپوكوتیل را در نور نشان دادند. این قبیل فتوتیپ ها ی وابسته به اكسین مشخصه جهش یافته هایی با تولید اضافی و زیاد IAA مثل yucca،sur2 هستند و در نگاه اول متناقض با این مسئله كهARF8 یك فعال كننده رونویسی ژنهای پاسخ دهنده به اكسین می باشد ظاهر می شوند. بررسی های بیشتر نشان داد بیان چندین ژن GH3، كد كننده آنزیم های متصل به IAA باعث كاهش اثر جهش یافته های arf8 می شود، با این حال بیان ARF8 در گیاهان به مقدار زیادی بالا رفت. این اطلاعات پیشنهاد می كند كه ARF8 ممكن است در مسیر پس خوردی منفی برای كنترلIAA از طریق فعالسازی بیان GH3 نقش داشته باشد و یك ارتباط نزدیك بین ترارسانی علامت اكسین و هموتسازی اكسین را پیشنهاد می كند(تعادل حیاتی). همچنین بررسی جهش یافته های ARF و AUX/IAA پیشنهاد می كند كه عمل مهمتر و بیشتری بین هر یك از اعضای خانواده ژنی مربوطه وجود دارد، در حقیقت چندین جهش یافته arf نقایض ویژه ای در رابطه با اكسین نشان می دهد كه نشان دهنده تخصص یافتگی عملكرد انها می باشد. همچنین، فتوتیپ موتان های با عمل اكتسابی غالب AUX/IAA متغییر بودن و تخصص یافتگی بسیار زیادی را نشان داده است. تمامی پروتئین های ARF به یك توالی تنظیمی عمومی AUXRE متصل می شوند. بعلاوه ، پروتئین های AUX/IAA برای بر همكنش با كمترین میزان ARF های فعال كننده ، تخصص یافتگی خاصی را نشان نمی دهند. برای مثال، چندین پروتئین AUX/IAA به صورت یكسانی، ARF7، ARF5 ، تنظیم كننده فعالیت رونویسی از یك ساختار گزارشگر reporter construct ، زمانیكه همزمان در پروتوپلاستهای هویج بیان می شوند را مهار می كند. این سوالی ایجاد می شود كه چه طور پاسخ های خاص مر بوط به اكسین بوجود می آید؟
كارهای اخیر پیشنهاد می كند كه این تخصص یافتگی ممكن است در بخش بزرگی توسط الگوهای بیان شده از هر دو پروتئین های ARF و AUX/IAA حاصل شده باشد.
جهش یافته های با عمل اكتسابی غالب در ژن های AUX/IAA (BDL/IAA12) باعث نقایص نموی جنین می شود كه همانند با عملكرد حذف شده در MP/ARF5 می باشد كه پیشنهاد می كند BDL فعالیت MP را تنظیم می كند.
در مقابل، جهش های هم ارز در دومینSHYz/IAA3 فتوتیپ كوتاهی هیپوكوتیل را ایجاد كرد، اما روی جنین زایی تاثیری نداشت كه این پیشنهاد می كند كه ARF مشخص را تنظیم می كند. Weijers و همكارانش؛ راهبرد جانشینی برای مشخص كردن اینكه ایا تنظیم رونویسی تمایزی از این دو ژنAUX/IAA در فتوتیپ های جهش یافته ها مشخصی شركت می كنند یا نه، استفاده كردند. به طور قابل ملاحظه ای ، جوانه های ترانس ژنیك بیان كننده الل غالب shy2-2 از پروموتور BDL فتوتیپ جنینی كه از نظر كیفیت همسان با موتان های bdl بودند را نشان دادند. متقابلا، طویل شدن هیپوكوتیل و نمو بخش رویشی در گیاهانpsHY2=bdl به طور برجسته ای با جهش یافته های shy2-2 مشابه بود. این یافته ها پیشنهاد می كند پروتئین های SHY2 ،BDL از نظر عملكردی برای پاسخ خاص به اكسین یكسان هستند و كنترل بیان رونویسی از AUX/IAA مهمترین تعیین كننده برای هدایت هستند به طوریكه پاسخ ها به اكسین به وسیله اعضای خاصی از خانواده AUX/IAA تنظیم می شود. بایستی توجه شود كه شواهد قوی برای تخصص یافتگی عمل پروتئین های AUX/IAA یافت شده است. در حالیكه ترانس ژنهای psHY2=bdl عمل phenocopy فتوتیپ های بخش رویشی از گیاهان shy2-2 را داشته، و فتوتیپ های agrovitropic رشد ریشه ای كه مشخصه جوانه های shy2-2 می باشد در ترانس ژنها دیده نشد، البته مطالعات بیشتر نیاز است، بدون شك تنظیم بیان اعضا خانواده AUX/IAA و ARF نقش مهمی در تعیین این تخصص یافتگی بازی می كند. مطالعات اخیر پیشنهاد می كند كه كنترل پس از رونویسی در بیان ARF نیز در تعیین الگوهای بیان دخالت می كند.microRNA ها(mi RNAS ) و trans-actiny short-interfiering RNA ها tasi-RNAS) ) می تواند با ایجاد شكستگی (برش) چندین رونوشتARF را بو وجود اورد. برای مثال، ARF16 ARF10 miRNA miR160 و رونوشت ARF17 را هدف گیری می كند. بیان زیاد miR160 نقایص راس ریشه ای مشابه با موتان های arf16 arf10 را به وجود اورد، در حالیكه بیان فرم های مقاوم به شكستگی از ARF16 یا ARF17 تعدادی نقایص وابسته به اكسین نشان می دهد كه نشان دهنده نقش حیاتی miRNAS در محدود كردن دومین بیان كننده ARF می باشد.




تنظیم پاسخ اكسین توسط SCF TIR1 ubiquitin-ligase




شناسایی ژنتیكی و بررسی جهش یافته های مقاوم به اكسین در ارابیدوبسیس توضیحات پربهائی را در مورد مكانیزم مولكولی تحت عمل اكسین اثبات كرده است. مطالعلت مولكولی و بیوشیمیایی تحت تاثیر محصولات ژنی توسط این جهش یافته ها، كمپلكس SCF TIR1 ubiquitin-ligase به عنوان تنظیم كننده را در مركز ترارسانی علامت اكسین قرار داده است. ubiquitin-ligaseیا انزیم های E3، تصال به پروتئین های سوبترا را كانالیز می كند. یوبی كوئیتینی شدن این سوبترا ها را برای پروتئولیز توسط پروتئازوم 26S نشان دار می كند. نوع . SCF ubiquitin-ligaseشامل خانواده بزرگ انزیم های E3 در ارابیدوبسیس می باشد.
این انزیم های چند زیر واحدی شامل SKP1 ، cullin1 و یك پروتئین Fbox و یك حلقه كوچك، دومین پروتئینی Rbx1/Roc1/Hrt1 می باشد. Cul1 به عنوان یك پروتئین ساختمانی عمل می كندریال RBX1 از طریق دومین C-terminal ، SKP1 از طریق دومین پایانهN متصل می باشند. پروتئین های F-box به هسته هتروترمیك از طریق بر همكنش بین دومین F-box و پروتئین SKP1متصل می شوند و به عنوان زیر واحد تنظیمی قابل تغییر می باشد كه سوبستراهای تازه به كمپلكس SCF برای یوبی كوئیتینی شدن از طریق آن متصل می شوند. TIR1 یكی از حدود 700 پروتئین F-box كد شده در ژنوم ارابیدوبسیس می باشد. جهش در TIR1 نقص پاسخ به اكسین شامل مقاومت در رشد ریشه در اثر كاهش در نمو ریشه جانبی می شود، مطالعات مولكولی تاثیر كرد كه TIR1 به عنوان پروتئین F-box می باشد. جهش در AXR6 (Auxin Resistant6) ژن كد كننده زیر واحد cul1 در نمایه های مقاوم به اكسین نیز جدا شده است و یافته های ژنتیكی معكوس برای نشان دادن اینكه ژنهای (Arabidopsis sKp1-like1)ASK1 و RBX1 نیز برای پاسخ به اكسین مورد نیاز است، استفاده شد. برخلاف جهش ها در TIR1، جهش یا ترانس ژنهایی كه هسته زیر واحدهای SCF به صورت خاصی بر ترارسانی علامت اكسین اثر ندارد. این یافته ها ثابت كرد كه كمپلكس SCF TIR1 یوبی كوئیتین-لیگاز به عنوان یك تنظیم كننده مثبت برای پاسخ به اكسین است و به عنوان مدلی شامل اینكه SCF TIR1- یوبی كوئیتین-لیگاز باعث یوبی كوئیتینه شدن مهار كننده ترار سانی علامت اكسین پیشنهاد شده است. جداسازی ژنتیكی چندین ژن AUX/IAA با افزایش عمل الل های ان، در نماهای مقاوم به اكسین دلالت بر این داشت كه پروتئین AUX/IAA به عنوان مهار كننده پاسخ به اكسین می باشد.(تصویر1)
بررسی های مولكولی نشان داد كه تمام این آسیب ها بارز،آمینو اسیدهای بسیار حفظ شده ای در دومین II در AUX/IAA تحت تاثیر قرار داده است. مطالعات ابتدایی روی پروتئین های AUX/IAA نشان داد كه این پروتئین ها بسیار ناپایدار بودند. این ناپایداری ناشی از دومین II است كه به عنوان degron عمل می كند، پروتئین های AUX/IAA برای یوبی كوئیتینی شدن توسط كمپلكس SCF TIR1 در پاسخ به تحریكات اكسین از طریق این دومین نشانه گذاری می شود. این به صورت ظریفی استفاده از یافته های مولكولی، ژنتیكی و بیوشیمیایی را همراه با هم نشان داد. اولا، دومین II باعث ناپایداری تنظیم شونده با اكسین برای پروتئین های متصل شونده luciferase و B-glucuronidase در شرایط ازمایشگاهی می شود. این اتصال نیازمند دومین II است و توسط جهش هایی كه باعث عمل بالای AUX/IAA می شود از بین می رود. سوما، جهش یافته هایی كه كمپلكس SCF TIR1 را تحت تاثیر قرار می دهد، باعث پایداری داخلی پروتئین های AUX/IAA شده، همان طور كه دومین II متصل به پروتئین های گزارش گر در شرایط ازمایشگاهی نشان داده بود. این ها و دیگر یافته پیشنهاد می كند كه این پاسخ به تحریك اكسین، پروتئین های AUX/IAA برای كمپلكس SCF TIR1 به كار برده شد و یوبی كوئیتینه شد.
سپس از هم پاشیدن AUX/IAA توسط پروتئازوم 26S مهار فاكتورهای رونویسی ARF را بر می دارد، بنابراین رونویسی وابسته به اكسین را قادر به تغییر می سازد. از انجائیكه جهش در دومین II باعث می شود توسط TIR1 شناسایی شود، باعث مهار كنندگی AUX/IAA مصون در مقابل پرتئولیز شود و باعث مهار فعالیت ARF می شود. این طور به نظر می رسد اكسین پروتئولیز پروتئین AUX/IAA و افزایش رونویسی ژن AUX/IAA را توسعه می دهد كه این پاسخ اخری احتمالا یك فیدبك منفی برای ضعیف كردن سیگنال اكسین است كه پاسخ گذارا به اكسین را تامین می كند.(تصویر2)










تصویر1- مدل SCF Ubiquitin Ligase








تصویر2-تنظیم پاسخ اكسین توسطSCFTIR1 ubuquitin Ligase


(a اتصال مهار كننده AUX/IAA به فاكتورهای رونویسی و مهار آن
(b پروتئولیز مهار كننده AUX/IAA توسط SCFTIR1 ubuquitin Ligase و در نتیجه فعال شدن رونویسی توسط فاكتور رونویسی






آخرین ویرایش: - -

 
سه شنبه 25 تیر 1392 11:08 ق.ظ
باسلام میتونید درمورد این دو موضوع به من کمک کنید
1. ABP1mRNA for actin dipolymerazing factor
2.الفا توبولین
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر