تبلیغات
زیست شناسی - الکتروفوز

الکتروفوز

سه شنبه 14 اردیبهشت 1389 12:41 ب.ظنویسنده : سید حسین نقیبی

 
آماده سازی نمونه برای الكتروفورز

محلول سازی

در نظر گرفتن ماهیت نمونه, در انتخاب راهکار مناسب برای محلول ساختن پروتئین های موجود در نمونه بسیار مهم است. در صورتیکه نمونه مورد نظر از منابع سلولی یا بافتی استخراج شود اولین قدم لیز سلولها و خارج ساختن محتوای پروتئینی آنهاست. روشهای متفاوت مکانیکی و شیمیایی درلیز و متلاشی ساختن سلولها به کار گرفته می شود. این روشها ممکن است روش های ملایمی چون شکست دیواره ی سلولهای باکتریایی توسط آنزیم لایزوزایم "Lysozyme", یا روشهای خشنی چون استفاده از پِرِس فرانسوی "French Press" برای متلاشی ساختن سلولهای مخمری باشد.

به هر حال در روش مطلوبِ محلول سازی برای الكتروفورز دو بعدی باید تمام پیوندهای غیركوالانت در كمپلكسهای پروتئینی شكسته شده و تجمع های پروتئینی به پلی پپتیدهای منفرد و محلول تبدیل شوند. به علاوه روش محلول سازی باید اجازه ی خارج ساختن موادی نظیر نمكها، لیپیدها، پلی ساكاریدها، و اسیدهای نوكلئیك را كه می توانند باعث اختلال درجداسازی توسط الكتروفورز دوبعدی شوند، بوجود آورد. درنهایت پروتئینهای نمونه باید درحین روند الكتروفورز دوبعدی محلول باقی بمانند. به همین دلایل محلول شدن نمونه یكی از عوامل بسیار حساس برای جداسازی پروتئینها توسط الكتروفورز دو بعدی است .

در این قسمت ابتدا به روشهای متداول در لیز و متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتئینی آنها می پردازیم. سپس اجزای موثر در روند محلول سازی را مورد بررسی قرار خواهیم داد.
3-3-1- روشهای متلاشی ساختن سلولها

روشهای متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتینی آنها, دامنه وسیعی از روش های فیزیکی و شیمیایی ملایم تا خشن را در بر می گیرد. ممکن است لیز سلولی به طور مستقیم در تماس با بافر محلول سازی صورت پذیرد یا در مواردی ممکن است از امواج مافوق صوت "Sonication" برای این منظور استفاده شود. حتی در برخی موارد ترکیبی از روشهای مختلف برای نیل به استخراج کامل پروتئین های نمونه استفاده می گردد.

متلاشی ساختن نمونه ها باید در سرما صورت پذیرد و نمونه مورد نظر در حین این روند باید روی یخ نگهداری شود. برای حفظ نمونه ی پروتئینی از عملکرد پروتئازهای آزاد شده در حین متلاشی ساختن سلولها باید تمهیداتی در نظر گرفته شود. یکی از روش های معمول متلاشی ساختن مستقیم سلولها در محلولهای لیز کننده ای است که سریعا" پروتئازها و دیگر فعالیت های آنزیمی را متوقف کنند, این محلولها عموما" دارای مواد دناتوره کننده ی قدرتمندی هستند.

بافرهای محلول سازی

بافرهای محلول سازی ممکن است به تنهایی یا در ترکیب با روشهای دیگر متلاشی سازی سلولی به کار گرفته شوند. برای انجام جداسازی مناسب در بعد اول, نمونه های پروتئینی باید باید کاملا" غیر توده ای و به صورت محلول باشند. این امر برای تمامی انواع نمونه ها در هر مرحله ای از آماده سازی ضروری است. برای این منظور معمولا", در ترکیب بافرهای محلول سازی از یک یا دو معرف کائوتروپیک, دترجنت, معرف احیا کننده, و آمفولایت استفاده می شود.

در این قسمت به معرفی این اجزا و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازی نمونه برای انجام الکتروفورز دو بعدی می پردازیم.
3-3-2-1- معرفهای کائوتروپیک

بسیاری از پروتئین ها در اشکال طبیعی (Native) دارای چندین شكل فضایی مختلف هستند و به همین دلیل ممکن است در الکتروفورز دو بعدی الگوهای پیچیده ای ایجاد کنند. این وضعیت تفسیر نمایه های دو بعدی را دچار مشکل خواهد کرد. برای ساده تر کردن نمایه دو بعدی و حذف اثر شکل فضایی در ایجاد نقاط متعدد مربوط به یک پروتئین و ایجاد شکلی منفرد از آن, برهم زدن شکل طبیعی (Denaturing) توسط معرفهای کائوتروپیک انجام می شود.

اوره مهمترین عامل كائوتروپیك در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی است که معمولاً با غلظت 8 مولار استفاده می شود. اوره از دو طریق مستقیم و غیر مستقیم باعث بر هم زدن شکل طبیعی و باز شدن تاخوردگی (Unfolding) مولکولهای پروتئینی می شود. مولکولهای اوره مستقیما" جذب گروه های آب دوست (Hydrophill) و قطبی در سطح پروتئین ها می شوند. این مولکولهای جذب شده به گروه های قطبی, اثر دفعی بر یکدیگر دارند. بر اثر این نیروی دفعی موجود در سطح, مولکول پروتئین باز شده و متورم می گردد. همین امر گروه های آب گریز در سطوح داخلی پروتئین را در معرض محیط خارجی قرار می دهد. ورود آب و اوره به محیط داخلی پروتئین سبب ایجاد بی ثباتی و برهم زدن شکل طبیعی پروتئین می شود.

از طرف دیگر, اوره از طریقی غیر مستقیم و با تغییر در ساختار و دینامیک آب می تواند در برهم زدن شکل طبیعی پروتئین نیز موثر باشد. حضور مواد غیر قطبی باعث اختلال در شبکه ی پیوندهای هیدروژنی بین مولکولهای آب شده و ایجاد فضایی خالی در بین مولکولهای آب می نماید, این کاهش نامطلوب در انتروپی با فشار مولکولهای آب به مولکولهای آب گریز جبران می شود تا کمترین فضای ممکن را اشغال نمایند. این پدیده به اثر آب گریزی (Hydrophobic effect) موسوم است. اوره در غلظت های بالا, 8-6 مولار, نیروهای موثر در متراکم کردن ساختمان پروتئین ها به خصوص اثر آب گریزی را کاهش می دهد. بدین ترتیب به طور غیر مستقیم قسمت های مرکزی آب گریز را در معرض و دسترسی عوامل محیطی قرار می دهد.

زمانی كه به شرایط كائوتروپیكی قوی نیاز باشد ، تركیبی از تیواوره 2 مولار و اوره 8-5 مولار مورد استفاده قرار می گیرد. تیواوره در مقایسه با اوره ماده ی دناتوره كننده ی بسیار قوی‌تری است. اما نمی توان آن را به تنهایی مورد استفاده قرار داد، چراكه حلالیت بسیار كمی در آب دارد. این ماده در محلول غلیظ اوره حلالیت بیشتری دارد. به همین دلیل مخلوط های اوره ـ تیواوره قدرت محلول كنندگی بهتری را از خود نشان می دهند. به علاوه این تركیب قادر به جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیك نیز هست كه در حضور اوره به تنهایی هم ممکن است فعّال باقی بمانند.

درجة خلوص اوره بسیار مهم است و باید از حرارت دادن آن, به دلیل تشكیل ایزوسیانات كه از تجزیه اوره حاصل می شود، خودداری کرد. ایزوسیانات باعث كربامیلاسیون پروتئین ها و تشكیل نقاط غیرواقعی در الگوی نهایی دو بعدی می شود. محلول حاوی اوره پایدار نیست و از ذوب و انجماد مكرر محلول حاوی اوره باید خودداری كرد. از طرفی دیگر, اگرچه استفاده از تیواوره در نمونه باعث افزایش در بروز نقاط پروتئینی در نقشه پروتئینی می شود اما ایجاد رگه های (Streaking) عمودی و نقاط مبهم و نامشخص در ناحیة اسیدی ژل را نیز سبب می شود كه هنوز راه حل مناسبی جهت حذف این زواید پیدا نشده است.
__________________
Success Consists of Going from Failure to Failure
without loss of Enthusiasm

Winston Churchill

آخرین ویرایش: - -

 
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر